研究前沿 | 藥物中亞硝胺類基因毒雜質的來源及控制策略

基因毒性雜質(genotoxic impurity，GTI)是指藥物中能直接或間接導致DNA受損引起基因突變，并具有致癌性或者潛在致癌可能性的一類雜質。由于其較一般雜質具有微量水平就存在潛在致突變性和致癌性風險的特點，受到藥品監管機構和制藥企業重點關注和嚴格控制。

2002年歐洲藥物管理局(EMA)最先出臺了關于基因毒性雜質的管理法規，美國食品藥物管理局(FDA)、國際人用藥品注冊技術要求國際協調會(ICH)等組織也針對基因毒性雜質先后頒發了相關界定、分類、限度、檢測和風險評估程序等一系列指南，目前已經成為藥品獲批及上市的關鍵指標之一。

我國對基因毒雜質的管理要求
國家食品藥品監督管理局于2016年發布的《化學藥品新注冊分類申報資料要求（試行）》（2016年 第80號）中提到過“結合起始原料和本品的制備工藝，簡述對原料藥可能存在的基因毒性雜質所進行的分析和研究的結果，并按照ICH M7指導原則的要求說明控制的策略”。
我國藥監部門于2017年6月加入ICH，后續2020版中國藥典四部通則部分，添加了《9306遺傳毒性雜質控制指導原則》，該指導原則的內容要求與ICH M7基本一致。
2024年1月5日，國家藥品監督管理局發布了決定使用《M7（R2）：評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險》國際人用藥品注冊技術協調會指導原則的公告。國內醫藥企業對于相關藥品遺傳毒性雜質的控制也應符合M7（R2）的指導要求。

基因毒性警示結構
所謂警示結構單元是指一些具有與遺傳物質發生化學反應能力的特殊結構單元，會誘導基因突變或者導致染色體重排或斷裂，從而具有潛在的致癌風險。警示結構單元是遺傳毒性雜質識別的起點。具有警示結構單元，但并未經實驗測試模型驗證的雜質叫做潛在遺傳毒性雜質。常見警示結構單元如圖1：

圖1 常見警示結構單元

可以發現，以上結構單元大部分都含有氨氮結構，其中亞硝胺類就是比較常見的一種基因毒雜質。
自2018年7月在纈沙坦原料藥中檢出N-亞硝基二甲胺（NDMA）以來，陸續在其他沙坦類原料藥中檢出了各類亞硝胺雜質，如NDMA、N-亞硝基二乙胺(NDEA)等。進一步的調查發現，在個別供應商的非沙坦類的藥物中（如雷尼替丁），亦有亞硝胺類雜質的檢出。亞硝胺類雜質屬于ICH M7（R1）(《評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險》)指南[1]中提及的“關注隊列”物質。根據世界衛生組織公布的致癌物清單[2]，NDMA和NDEA均屬于2A類致癌物質；根據國際認可數據庫，已有部分亞硝胺類雜質有公開的致癌性數據，如NDMA、NDEA、N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）等。

隨著對亞硝胺類雜質的日益關注，美國藥典（USP）也在不斷更新亞硝胺藥物分析雜質，目前總計達到49種，簡單亞硝胺和NDSRIs的雜質清單還在持續豐富中。為了保證藥品的安全和質量可控，實現有效的風險控制，提供更加可靠的數據支持[3]。

亞硝胺類雜質來源

根據目前所知，亞硝胺類雜質有多種產生原因[4]，如工藝產生、降解途徑和污染引入等。具體來講，亞硝胺類雜質可能通過以下途徑引入[5]：

（一）由工藝引入亞硝胺類雜質的風險

以沙坦類藥物的合成為例，四唑的環化是由有機腈與疊氮化鈉的環加成反應在高沸點溶劑（如二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮）中實現的，反應結束后，過量的疊氮化鈉用亞硝酸鈉淬滅。然而在這個過程中使用的二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中分別含有二甲胺和4-甲氨基丁酸雜質（這些雜質即可能是這些溶劑的合成原料，也可能是溶劑分子降解的產物）。這些仲胺在疊氮化鈉的淬滅反應中與淬滅劑亞硝酸鈉作用，產生了相應的亞硝胺NDMA (二甲基亞硝胺) 和NMBA (N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸)。
這個過程是沙坦類藥物產生亞硝胺雜質的根本原因（圖2）。尤其是考慮到疊氮化鈉淬滅是整個沙坦合成工藝的最后一步，產生的亞硝胺雜質污染最終產品的可能性大大增加。

圖2 沙坦類藥物可能引入亞硝胺類雜質過程示例

（二）由污染引入的風險

原料藥生產過程中使用了被亞硝胺類雜質污染的物料（起始物料、中間體、溶劑、試劑、催化劑等）可能帶來亞硝胺類雜質的風險。

使用回收的物料亦有引入亞硝胺類雜質的風險。已發現的回收物料被亞硝胺污染的實例包括鄰二甲苯、氯化三丁基錫（用作疊氮化三丁基錫的來源）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）。

（三）降解產生風險

某些藥物本身會降解產生亞硝胺類雜質，如雷尼替丁在高溫下會產生亞硝胺類雜質[6]；氨基比林中二甲氨基自身水解也會生成二甲基亞硝胺（圖3）。

圖3 氨基比林降解導致二甲基亞硝胺形成的機理

（四）制劑過程中形成

2019年9月，一份新的二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺產生機理報告被遞交到了監管部門。該報告提出，NDMA/NDEA似乎是在蓋箔印刷過程中形成的，N-亞硝胺的形成是由蓋箔中的硝化纖維素與含胺印刷油墨（二甲胺和二乙胺）反應引起的，并通過汽化和冷凝熱封起泡過程轉移到在成品上。由于增塑硝化纖維碎片的爆燃溫度，在熱誘導分解時會產生不同的氮氧化物。從硝酸纖維素中釋放出氮氧化物以及隨后在印刷藥物油墨中對胺進行亞硝化被認為是合理的。

針對以上產生途徑，FDA在2024年4月11日-12日組織的年度仿制藥論壇中，也給API生產商提出了如下建議：

l  從整體上評估原料藥合成路線，規避亞硝胺類在反應中產生，或將可能性降到最低；

l  對原材料和中間供應商進行評估和審計，如果發現亞硝胺雜質的風險，應使用高靈敏度且經過驗證的方法進行確認；

l  如果檢測到亞硝胺類物質，應進行根本原因分析，必要時變更生產工藝，以防止/減少亞硝胺類物質的生成；

l  如實向FDA報告進行變更的內容

亞硝胺類基因毒雜質控制策略

（一）基本控制理念

由于亞硝胺類雜質在人體中可接受限度較小，微量雜質的檢測和控制難度大。因此對于亞硝胺類雜質的控制應采取避免為主，控制為輔的策略。

1）避免為主是指在藥品的研發階段應根據亞硝胺類雜質產生的原因從原料藥工藝路線的選擇、物料的選擇與質控、工藝條件的優化等方面盡量避免亞硝胺類雜質的產生，并在生產過程中嚴格執行各操作規范。藥品上市許可持有人/藥品生產企業應與各物料（原料藥應包括起始物料、溶劑、試劑、催化劑、中間體等，制劑應包括原料藥、輔料、包材等等）生產商充分溝通，對物料生產和回收工藝進行系統評估。

若評估發現有生成亞硝胺類雜質的風險，應首先分析亞硝酸鹽或者可能形成亞硝胺類雜質的相關試劑和溶劑在工藝中使用的必要性，盡量避免選擇可能生成亞硝胺類雜質的生產工藝[6]。

2）控制為輔的策略是指當評估藥品具有亞硝胺類雜質殘留風險且相關工藝無法避免時，應盡可能將該步驟調整至工藝的早期，利用后續多步驟的操作降低亞硝胺類雜質殘留風險。同時須根據工藝路線分析可能生成的亞硝胺結構，并優化工藝，制定詳細的過程控制策略，保證生產過程中此類雜質的有效去除。

由降解產生亞硝胺類雜質的情況，應分析降解產生的條件，通過優化生產工藝、處方、貯存條件等，降低降解雜質的產生風險。

（二）限度控制

藥物中亞硝胺類雜質的控制策略建議參考ICH M7（R1）指南的相關規定，應保證最終擬定的控制策略和雜質限度具有充分合理的科學依據。亞硝胺類雜質的致癌風險較高，不適合按照ICH M7（R1）提出的1.5μg/天的毒理學關注閾值（TTC）控制限度。

1）應使用來自研究設計完善的致癌性試驗中的最低TD50值，或與人類風險評估最相關的種屬、性別和腫瘤發生器官部位的最低TD50值來計算可接受攝入量，設定對應腫瘤發生風險為十萬分之一，人體體重統一按50kg計算，則該亞硝胺類雜質的每日可接受攝入量（Acceptable Intake，AI）為：TD50（mg/kg/天）×50kg/50000。

2）未能在權威機構數據庫中查詢到TD50值時，可選用以下幾種方法分別獲得該亞硝胺類雜質的控制限度，并建議取其中最小值：

A.可以參考國際權威機構，如WHO、國際化學品安全性方案（International Programme on Chemical Safety，IPCS）等公布的數據或建立的風險評估方法。

B.與已有TD50值的亞硝胺類雜質結構相似，可以導用其TD50值計算雜質限度。

（三）檢測方法的建立

藥物中亞硝胺類雜質的分析測試方法，可以參考權威機構發布的方法，亦可自行開發方法，均需注意分析方法靈敏度應與所論證的雜質限度相匹配，并采用雜質對照品進行完整的方法學驗證，保證亞硝胺類雜質能夠準確有效的檢出。若采用自行開發方法，需證明該方法等效于或者更優于同品種官方公布的方法。

（四）全生命周期的風險控制

對于申報上市的產品，申請人在研發中，應進行亞硝胺類雜質的風險評估，對明確有亞硝胺類雜質潛在風險的品種應進行充分的研究，在申報資料的相應章節提交亞硝胺類雜質的研究資料及檢測結果，同時應注意用于研究的樣品的批次、批量必須具有代表性以及科學依據。

對于已上市藥品，藥品上市許可持有人/藥品生產企業也應主動對于亞硝胺類雜質存在的風險進行評估，若存在潛在的亞硝胺類雜質產生風險，可參照本指導原則以及其他相關指導原則的要求進行研究，根據研究結果采取相應的措施，以防止或最小化患者亞硝胺類雜質的暴露。

我們的優勢

1.  擁有國際化分析實驗室網絡的領導者（遍及美國，歐洲，亞洲）

2.  擁有國內先進的cGMP合規服務實驗室，進行方法學驗證，適用于各種藥物制劑及原輔料的檢測，滿足美國市場、歐洲市場注冊申報的要求

3.  擁有國內先進的分析設備，如Q-TOF-MS，GC-MS/FID，LC-MS/MS等，能夠根據客戶要求，開發足夠靈敏的基因毒雜質的分析方法

4. 擁有經驗豐富的科研人員，能夠對亞硝胺類（NDMA/NDEA/NMDA/NTTP）、苯磺酸酯類、鹵代烴類、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯等各類基因毒雜質進行分析方法的開發、驗證和測試工作

目前SGS已完成的亞硝胺雜質展示如下（表1）。最近熱度較高的西格列汀二甲雙胍緩釋片中的NTTP亞硝胺雜質的測試，也能夠按照比較成熟的方案，進行方法的開發、驗證和測試。

表1  N-亞硝胺基因毒雜質能力展示

參考文獻

1. ICH M7(R1)  Assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals of limit potential carcinogenic risk [EB/OL] (2017-03-31)

2. 世界衛生組織國際癌癥研究機構致癌物清單，http://samr.cfda.gov.cn/WS01/CL1991/215896.html

3. 美國藥典官方網站, https://www.usp.org/

4. (a) Assessment report, 14 February 2019, EMA/217823/2019. (b)A Screening Procedure for the Formation of Nitroso Derivatives and Mutagens by Drug-Nitrite Interaction, Chem. Pharm. Bull. 1982, 30(9), 3399-3404. (c) Formation of N-Nitrosodimethylamine (NDMA) from Dimethylamine during Chlorination, Environ. Sci. Technol. 2002, 36, 588-595. (d) N-nitrosomethylanlaniline, Org. Synth. 1933, 13, 82. (e) Nitrosomethylurea. Org. Synth. 1935, 15, 48.

5. (a) Information on nitrosamines for marketing authorisation holders，EMA/189634/2019. (b) Questions and answers on “Information on nitrosamines for marketing authorisation holders”，EMA/CHMP/428592/2019 Rev.1

6. Questions and Answers: NDMA impurities in ranitidine (commonly known as Zantac)，https://www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/

7. Inhibition of Nitrosamine Formation by Inorganic and Organic Salts, Chem Pharm Bull, 1986, 34(8), 3485-3487.